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各種轉(zhuǎn)染試劑中文說明
1.細(xì)胞接種：細(xì)胞密度 2-6 x106 cells/mL.
2.質(zhì)粒的準(zhǔn)備：在 5％最終培養(yǎng)體積的 DMEM 或培養(yǎng)基中，每 10 6 個(gè)細(xì)胞稀釋1.0 ug pDNA。
3. PEI 的準(zhǔn)備：在 5％最終培養(yǎng)體積的 DMEM 或培養(yǎng)基中，每 10 6 個(gè)細(xì)胞稀釋3.0 ug PEI Prime，混勻通過快速，短暫渦旋或顛倒數(shù)次試管，將 pDNA 和 PEI Prime 溶液混合在一起。
4. 使 pDNA 和 PEI 的混合物在室溫下靜置 10 分鐘。一邊旋轉(zhuǎn)板，一邊將 pDNA 和 PEI 混合物逐漸滴加到細(xì)胞中。
5.于 37℃ CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
二、Effectene Transfection Reagent(Qiagen) 轉(zhuǎn)染步驟：
說明：以下步驟適用于在 6 孔培養(yǎng)板中轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞。開始時(shí)，每 6 孔培養(yǎng)板使用 0.4ug DNA。盡管 DNA 的量看起來很少，但已足夠用于轉(zhuǎn)染。如果想獲得最高的轉(zhuǎn)染效率，對(duì)每種細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染條件都要進(jìn)行優(yōu)化。
轉(zhuǎn)染前一天，用 5ml 含血清和抗生素的培養(yǎng)基分裝使每 6 孔培養(yǎng)板含 2-8×105的細(xì)胞（根據(jù)細(xì)胞類型而定）。在細(xì)胞的正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)（通常 37℃和 5％CO2）。轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞應(yīng) 40-80％融合。轉(zhuǎn)染時(shí)，用 DNA 濃縮緩沖液（EC Buffer）稀釋 1ug DNA 至 100ul 總體積（DNA 用 pH 7-8 的 TE Buffer 溶解，DNA 濃度：0.1ug/ul）。加入 3.2ul Enhancer， 渦旋 1s 以混合溶液。
重要：請(qǐng)保持 DNA 與 Enhancer 比例恒定。
注意：質(zhì)粒 DNA 的質(zhì)量會(huì)顯著影響幾個(gè)轉(zhuǎn)染參數(shù)如轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性、以及對(duì)于結(jié)果的解釋。因此，只應(yīng)該使用最高純度的 DNA。室溫（15-25℃）孵育 2-5 分鐘，離心（spin down）幾秒鐘以從管頂去除液滴。向 DNA-Enhance 混合液中加入 10ul Effectene Transfection Reagent，反復(fù)吸取 5
次或渦旋 10 秒鐘以混合。
注意：沒必要一直把 Effectene Reagent 置于冰上。在室溫中放置 10-15 分鐘不會(huì)改變它的穩(wěn)定性。
室溫下（15-25℃）孵育 5-10 分鐘以形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。孵育過程中，從培養(yǎng)板上輕柔地吸出培養(yǎng)液，用 4ml PBS 洗滌一次細(xì)胞。加入1.6ml 新鮮培養(yǎng)液（可以包含血清和抗生素）到細(xì)胞中。加入 0.6ml 培養(yǎng)液（可以包含血清和抗生素）至包含轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染復(fù)合物的 EP 管中。吸取兩次以混合，立即將轉(zhuǎn)染復(fù)合物 drop-wise 加入 6 孔培養(yǎng)板的細(xì)胞中。輕搖培養(yǎng)板使轉(zhuǎn)染復(fù)合物分布均勻。將細(xì)胞與轉(zhuǎn)染復(fù)合物在它們的正常培養(yǎng)條件下孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間直至轉(zhuǎn)染基因表達(dá)。孵育時(shí)間和由所采用的實(shí)驗(yàn)和所使用的基因決定。
Optional: 大多數(shù)情況下，不需去除轉(zhuǎn)染復(fù)合物。然而，如果觀察到細(xì)胞毒性，則需在轉(zhuǎn)染后 6-18 小時(shí)移除 Effectene-DNA 混合物，用 PBS 洗滌一次細(xì)胞， 然后加入 5ml 新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液。
瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)，進(jìn)一步試驗(yàn)分析轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。
轉(zhuǎn)染β-gal 或 cat 報(bào)告基因的重組子常在轉(zhuǎn)染后孵育 24-48 小時(shí)以使轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時(shí)，在轉(zhuǎn)染后 24-48 小時(shí)，將細(xì)胞以 1:5~1:10 傳代至合適的選擇性培養(yǎng)基中。保持細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中直至克隆出現(xiàn)。
注意：我們推薦對(duì)每一細(xì)胞系和使用的抗生素建立一個(gè)致死曲線（劑量-反應(yīng)曲線）。但是一定要記住致死曲線受細(xì)胞密度的影響。
以下步驟有時(shí)是必須的：將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞置于它們正常的培養(yǎng)液（如：不含選擇性抗生素的培養(yǎng)液），然后孵育 1-2 天，然后再加入選擇性培養(yǎng)液。
