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利用Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析法分離純化 IgG1

 發(fā)布時(shí)間:2023/7/12 點(diǎn)擊量:1469

簡(jiǎn)介

Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析法純化 IgG1 是利用在中性 pH 環(huán)境中 Q SepharoseFast Flow 更傾向于結(jié)合小鼠腹水中的非目的蛋白,故在用鹽溶液梯度洗脫時(shí),McAb 會(huì)較早被洗脫或出現(xiàn)在穿過(guò)液中,從而可得到分離純化的 IgG1。

原理

Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析法純化 IgG1 的基本原理是 Q Sepharose Fast Flow 為強(qiáng)陰離子交換介質(zhì),具有流速快(最高流速 750 ml/min)、高量(120 mg HAS/ml)的特點(diǎn)。

小鼠 IgG1 PI 范圍為 pH7.08.5,而白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白的 PI 范圍為 pH4.7-5.0,因此,在中性 pH 環(huán)境中 Q SepharoseFast Flow 更傾向于結(jié)合小鼠腹水中的非目的蛋白。故在用鹽溶液梯度洗脫時(shí),McAb 會(huì)較早被洗脫或出現(xiàn)在穿過(guò)液中,從而可得到分離純化的 IgG1

材料與儀器

器材:0.45μm 濾膜、XK 16/20 層析柱,FPLC 層析系統(tǒng)。

 

試劑:

 

① Q Sepharose Fast Flow 強(qiáng)陰離子層析分離填料。

起始緩沖液:0.02mol/L Tris-HCl 緩沖液,pH7.5。

洗脫緩沖液:1.0mol/L NaCl-0.02mol/L Tris- HC1 緩沖液,pH7.5。

再生溶液:0.1mol/L NaOH。

步驟

Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析法純化 IgG1 的基本過(guò)程可分為如下幾步:

 

1)樣品準(zhǔn)備

A 小鼠腹水離心去雜質(zhì),飽和硫酸銨鹽析并除鹽,0.45μm 濾膜過(guò)濾。

 

2)分離純化

A 按照 Q Sepharose Fast Flow 生產(chǎn)廠家提供的說(shuō)明書(shū)處理填料,按照 XK 16/20 層析柱使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行裝柱。

B 5 ml/min 的流速,用起始緩沖液充分平衡層析柱,至流出液的 pH 值與初始緩沖液相同,約 3 倍層析柱體積,走出一穩(wěn)定基線。

C 上樣后,采用 2 ml/min 的流速,以 2-3 倍層析柱體積的起始緩沖液洗掉非結(jié)合蛋白,即穿過(guò)液中檢測(cè)不到蛋白峰。

D 5 ml/min 的流速加入洗脫緩沖液,則 NaCl 濃度形成連續(xù)梯度,IgG1 將首先被洗脫而流出層析柱。

E 純化的 McAb 可經(jīng)超濾離心管濃縮,BCA 法測(cè)定 McAb 蛋白含量,分裝凍存。

F 洗脫結(jié)束后,以 5 ml/min 的流速,2-5 倍層析柱體積的再生溶液對(duì)層析柱進(jìn)行再生。用初始緩沖液重新平衡層析柱,以備下次使用。

注意事項(xiàng)

1.純化前所有緩沖液、樣品及層析柱都必須平衡至室溫,以避免產(chǎn)生氣泡。

2.純化前樣品、緩沖液須用 0.45μm 濾膜過(guò)濾去除顆粒性物質(zhì),以防層析柱被堵塞而降低純化效果。

3.不同類(lèi) McAb 的等電點(diǎn)變化范圍較大,即使在同一類(lèi)的不同亞類(lèi) McAb 之間,其等電點(diǎn)也有較大差異(表 1-3)。因此,在純化不同類(lèi)或亞類(lèi)的 McAb 時(shí),還須進(jìn)行純化條件的優(yōu)化。

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4. 為確保層析柱的使用壽命和載量,及時(shí)清洗非常重要,清洗完成后用起始緩沖液重新平衡。

5. 層析柱可于 4℃、20% 乙醇中長(zhǎng)期保存。

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